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引物設(shè)計(jì),PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則是什么?

2022-4-23 09:06| 發(fā)布者: admin| 查看: 1133| 評(píng)論: 0

1、引物設(shè)計(jì):pcr引物設(shè)計(jì)的基本原則有哪些

2、引物設(shè)計(jì):引物設(shè)計(jì)原則是什么?

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首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ),其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu),再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。

具體實(shí)現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素,如引物長(zhǎng)度(primerlength),產(chǎn)物長(zhǎng)度(proctlength),序列Tm值(meltingtemperature),引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)。

形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(plexformationandhairpin)的能值,在錯(cuò)配位點(diǎn)(falseprimingsite)的引發(fā)效率,引物及產(chǎn)物的GC含量(composition),等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾,如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),引進(jìn)突變等。

一、引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)。

二、引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

三、再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。

3、引物設(shè)計(jì):引物設(shè)計(jì)原則是什么?

3、引物設(shè)計(jì):引物設(shè)計(jì)原則是什么?

引物設(shè)計(jì)原則是:

1、引物長(zhǎng)度一般為15-,常用的為18-,但不能大于。

2、引物GC含量一般為40%-60%,以45-55%為宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。

3、引物所對(duì)應(yīng)的模板序列的Tm值**在72℃左右,至少要在55-80℃之間,Tm值曲線以選取72度附近為佳,5'到3’的下降形狀也有利于引物與模板的結(jié)合。

4、ΔG值(自由能)反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度,3'端的ΔG值相對(duì)要低,且**值不要超過9,否則不利于正確引發(fā)反應(yīng),3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時(shí),PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百,但在-6時(shí)只達(dá)到40%,-8時(shí)少于20%,-10時(shí)接近于0。

5、錯(cuò)配率一般不要超過,否則會(huì)出現(xiàn)非目的條帶。但對(duì)于某些特定的模板序列,還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大,比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為以上,而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為,并且不好找到其他更合適的引物,那么這對(duì)引物是可以接受的。

4、引物設(shè)計(jì):引物設(shè)計(jì)中的F、R表示什么?

4、引物設(shè)計(jì):引物設(shè)計(jì)中的F、R表示什么?

正向引物,反向引物。

引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。連續(xù)互補(bǔ)的堿基應(yīng)該要少于4個(gè)。引物應(yīng)使其G值不要太高,G值越大,則雙鏈越穩(wěn)定。

引物長(zhǎng)度和GC含量要適中。引物長(zhǎng)度大概為18~,但不應(yīng)大于,引物過短會(huì)影響到擴(kuò)增的特異性,太長(zhǎng)的話其延伸溫度將會(huì)大于74℃,不利Taq酶的催化反應(yīng)。若擴(kuò)增產(chǎn)物為4~5kb,引物**不要少于。

注意事項(xiàng):

1、引物的長(zhǎng)度一般為15-30?bp,常用的是18-27?(22)bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq?DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。?

2、堿基要隨機(jī)分布:引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)(False?priming)。降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布**是隨機(jī)的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

3、3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C,如GGG或CCC,因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

4、引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率,末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基,因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。

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